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ARTIGO ORIGINAL

Avaliação de danos genotóxicos e citotóxicos em células da mucosa bucal de soldadores nas cidades de Cubatão e Santos, São Paulo

Evaluation of genotoxic and cytotoxic effects in buccal mucosa cells of welders in the cities of Cubatão and Santos, state of São Paulo, Brazil

Laiane Damara Oliveira do Vale1; Victor Hugo Pereira da Silva2; Flavio Rossi de Almeida1; Daniel Araki Ribeiro2; Daniela Martins da Silva1

DOI: 10.5327/Z1679443520170012

RESUMO

CONTEXTO: Estima-se que no mundo existam, aproximadamente, 5 milhões de trabalhadores expostos ocupacionalmente à fumaça de soldagem. Níquel e Cromo são metais que podem ocasionar danos ao material genético, e soldadores, por força do ofício, são rotineiramente expostos a eles.
OBJETIVO: O objetivo do presente estudo foi investigar a frequência de danos citotóxicos e genotóxicos em células da mucosa bucal de um grupo de soldadores.
MÉTODOS: Um total de 44 indivíduos, distribuídos em 2 grupos — soldadores e não soldadores —, foi comparado utilizando a técnica do ensaio do micronúcleo e morte celular (picnose, cariorrexe e cariólise) em células da mucosa oral de trabalhadores de soldagem. As células examinadas foram coradas com Feulgen/Fast-green.
RESULTADO: Os soldadores apresentaram maior frequência (p<0,05) de alterações indicativas de citotoxicidade quando comparados ao grupo de indivíduos não expostos a fumos metálicos.
CONCLUSÃO: Os resultados deste estudo preliminar sugerem que soldadores apresentam maior frequência de danos citotóxicos e morte celular em células da mucosa bucal que trabalhadores não expostos.

Palavras-chave: micronúcleos com defeito cromossômico; dano no DNA; estresse oxidativo; genotoxicidade; morte celular.

ABSTRACT

CONTEXT: It is estimated that approximately 5 million workers are occupationally exposed to welding fumes worldwide. Nickel and Chromium are genotoxic metals found in welding fumes and thus welders are exposed to these metals at the working place.
OBJECTIVE: The objective of this study was to investigate the frequency of cytotoxic and genetic damage in cells harvested from the oral mucosa of welders and also from a group of workers not exposed to metallic fumes.
METHODS: A total of 44 individuals, divided into 2 groups — welders and not-welders — were compared using the micronucleus assay technique and cell death (pycnosis, karyorrexis and karyolysis) in buccal mucosa cells of welding workers. The cells examined were staining with Feulgen/Fast-green.
RESULTS: Welders presented higher frequency (p<0.05) of cytotoxicity than the group of volunteers who were not exposed to metallic fumes.
CONCLUSION: The results from this preliminary study suggest that welders may have a higher frequency of cytotoxic damage in buccal mucosa cells than non-welding workers.

Keywords: chromosome-defective micronuclei; DNA damage; oxidative stress; genotoxicity; cell death.

INTRODUÇÃO

Estima-se que no mundo existam, aproximadamente, 5 milhões de trabalhadores expostos à fumaça de soldagem1 em seus locais de trabalho.

Esses trabalhadores podem ser expostos ao Cromo (Cr) e ao Níquel (Ni) presentes nas fumaças provenientes de processos de solda metálica2. Apesar dos metais e suas concentrações variarem dependendo do tipo de soldagem e do material a ser soldado, a presença desses elementos na composição é fundamental, já que garantem ao metal alta resistência à corrosão3.

Contaminantes ambientais — sejam físicos, biológicos ou químicos — possuem a capacidade de alterar e/ou lesionar o material genético humano, causando mutações4. Há diversas vias de exposição à contaminação ocupacional — como a dérmica e a por ingestão; na ocupação de soldador, a inalação é a principal rota de exposição5. Os efeitos da ação desses metais, como o Ni e o Cr (VI), podem ser diretos ou indiretos. Os primeiros compreendem a inibição enzimática, a quelação de elementos vitais e a ligação a grupos sulfidrilas em proteínas; e nos efeitos indiretos são comuns os processos de ativação de vias de sinalização NF-κB, AP-1 e P53 e danos em biomoléculas por meio de danos oxidativos6. O Cr (VI) é uma forma encontrada nos processos de soldagem7 e que produz, nas células, formas intermediárias que implicam a reação de Fenton, que geram radicais livres por meio da interação dos metabólitos da água com os metais, podendo favorecer o surgimento de danos estruturais no DNA, como quebras de fita, aberrações cromossômicas e ligações cruzadas, bem como sinalizar as células para a morte8-10.

Diante do colocado, uma das profilaxias para diminuir a ocorrência de intoxicações ocupacionais é o monitoramento biológico11. Há uma crescente busca por metodologias no intuito de se detectar e, por conseguinte, mensurar o risco corrido pelas populações humanas que estão expostas a diversos agentes cancerígenos, ou mesmo àqueles considerados suspeitos. Esses ensaios têm sido aplicados com sucesso para identificar fatores dietéticos, ocupacionais, ambientais e genéticos que causam impacto significativo sobre a estabilidade genômica12.

O ensaio do micronúcleo na mucosa bucal é um biomarcador utilizado em testes de avaliação de eventos mutagênicos e citotóxicos por ser minimamente invasivo, podendo, assim, expressar o dano genético durante a divisão celular e outras alterações nucleares que refletem índices de morte celular, e também por ser o epitélio oral uma das primeiras barreiras de contato com as substâncias por via oral ou inalatória13,14.

O objetivo do presente estudo foi verificar a frequência de alterações de mutagenicidade e citotoxicidade em células da mucosa bucal de soldadores em razão da exposição a partículas metálicas geradas nos processos de soldagem.

 

MÉTODO

PARTICIPANTES DA PESQUISA

O estudo compreendeu uma amostra de 44 voluntários do sexo masculino, soldadores que trabalhavam em diversas metalúrgicas nas cidades de Cubatão e Santos, São Paulo, no período entre julho e setembro de 2016. A amostra foi dividida em dois grupos — expostos e não expostos a metais —, com 22 participantes cada. O grupo não exposto a metais foi selecionado considerando-se a situação ocupacional, dando preferência a profissionais de ensino, comércio, saúde e pesquisa, para evitar o contato com possíveis agentes de ação genotóxica estabelecida, na tentativa de reduzir fatores de conflito. Características individuais dos voluntários foram coletadas e estão detalhadas na Tabela 1. Foram incluídos neste estudo indivíduos que aparentavam boas condições de saúde, que não foram expostos a raios X nos 15 dias anteriores à coleta das amostras, que não utilizavam diariamente fármacos com finalidade terapêutica, que não possuíam lesões infecciosas e neoplásicas na mucosa bucal e sem histórico de neoplasia, tendo sido pareados de acordo com sexo, idade e hábitos tabagistas, sempre obedecendo aos mesmos critérios de inclusão, para garantir reprodutibilidade ao estudo. A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Paulista (UNIP) sob o Parecer (Sigma). As lâminas foram examinadas em magnificação total de nº 1.555.64 CAEE: 55441816.2.0000.5512. 400x para análise em microscópio, sendo avaliado um total de 1.000 células por indivíduo.

 

 

COLETA DO MATERIAL, PREPARO DA LÂMINA E ANÁLISE

O teste do micronúcleo em células da mucosa bucal foi executado conforme a metodologia usada por Meireles et al.15 Foi solicitado a cada participante o enxágue prévio da mucosa com bochecho de água de torneira. Em seguida, utilizando uma espátula de madeira, o material foi coletado com leve fricção na mucosa jugal e o conteúdo celular foi depositado em tubo tipo Falcon — contendo soro fisiológico refrigerado —, sendo fixado em solução de ácido acético/metanol 3:1. No processo de coloração, as lâminas foram imersas em solução de HCl a 5 N durante 15 minutos, lavadas e deixadas em água destilada por 15 minutos e, posteriormente, coradas com o reagente de Schiff (Merck, Darmstadt, Alemanha) durante 90 minutos e contra-coradas com Fast-Green (Merck, Darmstadt, Alemanha) a 1% durante aproximadamente 30 segundos. Após o processo de coloração, as lâminas foram desidratadas em três banhos de álcool absoluto e posteriormente clarificadas em dois banhos de xilol e montadas com lamínulas utilizando seladora Entellan (Sigma). As lâminas foram examinadas em magnificação total de 400x para análise em microscópio, sendo avaliado um total de 1.000 células por indivíduo.

Os parâmetros adotados para contagem das células foram:

• células normais com núcleo oval ou redondo, com dimensão maior e com menor relação nuclear/citoplasmático — nessas células, nenhum outro conteúdo de DNA é observado além do núcleo;

• micronúcleos, que se distinguem pela presença de um núcleo principal e um ou mais núcleos menores, geralmente redondos, com diâmetro variando entre 1/3 e 1/6 do núcleo principal;

• picnose, caracterizada por um núcleo com menor tamanho, mas intensamente corado, com diâmetro que varia de 1/3 a 2/3 do núcleo das células normais;

• cariorrexe, aparecimento mais extenso de agregação cromatina nuclear, levando à fragmentação e à desintegração do núcleo; e

• cariólise, identificada pela perda completa do material genético e sua ausência, não sendo possível ver a coloração da reação de Feulgen, indicativa de processo tardio de morte celular16 (Figura 1).

 


Figura 1. Alterações nucleares das células esfoliativas da mucosa bucal: (A) célula normal diferenciada, (B) célula com micronúcleo, (C) célula em cariorrexe, (D) célula em cariólise e (E) célula em picnose.

 

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram apresentados como média e desvio padrão da média (DP). A comparação entre grupos foi realizada pelo teste U de Mann-Whitney. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05. Os dados foram analisados utilizando o software Graph Pad Prism versão 7.0.

 

RESULTADOS

Foram avaliadas as características dos sujeitos do estudo com relação à idade média, ao tempo de profissão e às horas trabalhadas por dia. Todos os indivíduos da pesquisa eram do sexo masculino; o grupo de soldadores apresentou idade média um pouco maior que o grupo não exposto, e todos os soldadores trabalhavam a mesma quantidade de horas por dia (Tabela 1).

Todos os parâmetros citotóxicos mostraram-se aumentados significativamente entre os voluntários do grupo exposto à soldagem. Com relação a células normais, soldadores apresentaram menor média (963,40) quando comparados ao grupo não exposto (984,31). As alterações celulares (picnose, cariorrexe e cariólise) obtiveram padrões significativamente diferentes entres os grupos (Tabela 2).

 

 

Com relação ao dano genotóxico (frequência de células com micronúcleo), não houve diferenças significativas entre os grupos (Tabela 3).

 

 

DISCUSSÃO

O constante contato do epitélio bucal com agentes presentes no ambiente, por exposição inalatória e oral, faz a aplicação desse método ser vantajoso em testes de biomonitoramento ocupacional16. O baixo custo, a facilidade de obtenção do material dada pela coleta minimamente invasiva, a possibilidade de verificação dos danos no DNA e a morte celular no epitélio se tornam interessante, já que 90% dos cânceres têm origem epitelial17. Em âmbito mundial, estudos ocupacionais semelhantes foram realizados: na Polônia, com trabalhadores expostos a cobre e arsênio18; na Índia, com trabalhadores industriais de fabricação de baterias expostos ao chumbo19; na Colômbia, com trabalhadores de mineração20. Vale ressaltar a dificuldade de se selecionar um grupo não exposto totalmente isento desse tipo de exposição, visto que, mesmo em baixas concentrações, os voluntários não expostos à soldagem vivem expostos a diversas substâncias cotidianas da vida moderna em zona urbana, onde a exposição a contaminantes, mesmo em nível mínimo, está presente.

No presente estudo, quando comparados o grupo de soldadores e o grupo de não soldadores, pode-se observar a maior ocorrência de citotoxicidade em soldadores. Os resultados sugerem os prováveis efeitos citotóxicos em soldadores devido à alta probabilidade de exposição a metais, como o Cr e o Ni, em decorrência das atividades de soldagem. No entanto, essa hipótese não pode ser confirmada por meio da metodologia utilizada por tratar-se de um estudo de natureza exploratória. Os dados referem-se a resultados preliminares que carecem de maiores investigações. Com relação à mutagenicidade, não foram encontrados resultados sugestivos.

Em um estudo austríaco realizado por Wultsch et al.21 com 22 soldadores, foi observado aumento no efeito citotóxico, mas não mutagênico, concordando com os dados da presente pesquisa. Já em outro estudo realizado no México com soldadores não foi encontrada a correlação entre a exposição e os parâmetros de mutagenicidade e citotoxicidade22. Outros dois estudos23,24 realizados na Índia, também com soldadores, observaram aumento na frequência dos marcadores de mutagenicidade em relação aos indivíduos não expostos. Contudo, questionam-se esses resultados positivos realizados na Índia, visto que a coloração usada no experimento, de Giemsa, poderia aumentar a ocorrência de falsos positivos21,22.

Nesta pesquisa encontramos aumento na frequência de anormalidades nucleares — como picnose, cariorrexe e cariólise, caracterizando a morte celular —, que ocorrem tanto nos processos de necrose quanto nos de apoptose25. As alterações conotam mecanismos reparadores de danos genéticos, podendo indicar instabilidade no genoma, já que quando ocorrem grandes instabilidades genômicas, são encaminhadas a processos apoptóticos26. Esse fato pode ser explicado, ainda, pela presente eficiência dos pontos de checagem no ciclo celular27, que também podem implicar na ocorrência de micronúcleos, já que células micronucleadas podem ser induzidas à morte e, assim, não são visualizadas28 .

Nem todos os mecanismos relacionados aos metais pesados são totalmente elucidados, porém, sabe-se de sua propriedade em gerar espécies reativas de oxigênio19,29. É o que ocorre com os radicais OH· que podem interferir nos mecanismos de reparo celular no DNA, no RNA, nas proteínas e nos lipídios e em membranas celulares do núcleo e mitocondrial30; são eventos que podem implicar na carcinogênese, na teratogênese e no envelhecimento precoce18,28,29. Na carcinogênese, por exemplo, a citotoxicidade pode acarretar lesão crônica seguida por aumento da multiplicação celular compensatória, hiperplasia e, então, desenvolvimento do tumor27. Sendo assim, há correlação entre a citotoxicidade e os danos genéticos, e o acúmulo desses danos no genoma podem favorecer a progressão de uma célula normal em maligna.

Os estudos sobre danos genotóxico e citotóxico em soldadores são raros e controversos. As medidas de proteção empregadas, os níveis de exposição e as concentrações dos metais variam de um ambiente ocupacional para outro, e são fatos que devem ser considerados, pois podem explicar os achados em determinados ambientes23.

No Brasil, a averiguação científica de riscos à saúde em decorrência da exposição ocupacional teve impulso com a criação das legislações de segurança do trabalho, já no final do século passado31. As disposições legais brasileiras sobre segurança do trabalho são feitas por meio das Normas Regulamentadoras32,33, que são bastante exigentes e determinam o uso de equipamentos de proteção individual e coletivo contra os riscos que podem ser encontrados no ambiente ocupacional. Porém, é rotineiro trabalhadores informais não fazerem uso dessas medidas, decorrente de processos culturais e educacionais. No presente estudo, embora 90% dos soldadores tenham afirmado que utilizam equipamentos de proteção obrigatórios, constatou-se, de forma observacional e empírica, que isso não era uma completa verdade. Durante as visitações a algumas instalações, observou-se que frequentemente os trabalhadores, sobretudo os trabalhadores informais, ora não utilizavam ora utilizavam, de forma irregular ou incompleta, os equipamentos de segurança. Nesse cenário, as empresas apresentam um controle mais rigoroso sobre o uso dos equipamentos de segurança.

Os biomarcadores utilizados neste estudo têm sido empregados para investigar se há risco de desenvolvimento de câncer do trato aerodigestivo superior. Contudo, outras doenças, como diabetes e câncer de mama, também têm sido associadas a maiores frequências de alterações desses marcadores34-36. A compreensão dessas questões, assim como os métodos de automação na análise — já que a análise por essa metodologia é subjetiva e depende da perícia do analista — facilitarão o entendimento do eixo dos estudos e possibilitarão uma investigação mais rápida e precisa.

Quanto aos achados observados, estudos adicionais com técnicas mais avançadas para avaliação de dano ou reparo no genoma, assim como estudos longitudinais, poderão esclarecer melhor o potencial de mutagenicidade e citotoxicidade presente em ambientes profissionais de soldadores.

 

CONCLUSÃO

No presente estudo, não foi observada frequência de dano genotóxico no grupo de trabalhadores expostos à fumaça de soldagem quando comparado ao grupo de não soldadores. No entanto, os resultados deste estudo preliminar sugerem que soldadores expostos apresentam maior tendência a apresentar dano citotóxico em células da mucosa bucal que trabalhadores não expostos.

 

AGRADECIMENTOS

Agradecemos especialmente ao Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro pelas contribuições dadas nas etapas de desenvolvimento da metodologia e dos instrumentos de avaliação. Agradecemos também a todas as empresas e aos voluntários que gentilmente se dispuseram a participar do nosso estudo.

 

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Recebido em 22 de Fevereiro de 2017.
Aceito em 27 de Setembro de 2017.

Trabalho realizado na Universidade Paulista (UNIP), em parceria com a Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) – Santos (SP), Brasil.

Fonte de financiamento: nenhuma


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